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Autor/a
González Camarero, Rebeca
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Abstract
La quitina es un polisacárido lineal compuesto por monómeros de NAG (N-acetilglucosamina) unidos por enlaces β-1,4. Es el amino sacárido natural más abundante y el segundo biopolímero natural más abundante en el mundo después de la celulasa. Las quitín desacetilasas (CDAs) N-desacetilan los residuos de NAG de los polímeros y oligómeros de quitina generando quitosanos y quitooligosacáridos parcialmente acetilados (paCOS). La quitina y sus derivados son moléculas muy interesantes pues presentan una amplia variedad de aplicaciones en la medicina y en la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética entre otras. El quitosano es el único polisacárido policatiónico natural, lo que le permite interactuar con biomoléculas polianiónicas (membrana, ácidos nucleicos, proteínas…). La actividad biológica del quitosano depende fuertemente del grado de acetilación (DA), su grado de polimerización (DP) y su patrón de acetilación (PA). Debido a esto y a que las diferentes CDAs generan diferentes PA y DA, es de gran interés caracterizar diferentes CDAs para que se puedan usar como catalizadores en la producción de quitooligosacáridos y paCOS con un PA y DA específico, de modo que puedan estudiarse sus actividades biológicas y usarse en diferentes campos.
El componente principal de la pared celular bacteriana es el peptidoglicano, que protege la célula frente a diversas condiciones ambientales y consiste en una cadena de glicano NAG-NAM covalentemente unida a un tallo peptídico (stem peptide). Las autolisinas intervienen en la continua síntesis, hidrolisis y modificación del peptidoglicano, permitiendo el crecimiento y división bacteriana, así como la realización de otras funciones biológicas (como patogenicidad, canibalismo, esporulación, germinación de esporas…). Además, los fragmentos de peptidoglucano liberados por estas autolisinas pueden ser detectados por el sistema inmune del huésped durante una infección, lo que produce una respuesta inmune. Para evitar esto, algunas bacterias patógenas modifican su peptidoglicano mediante diferentes mecanismos. Uno de estos mecanismos es llevado a cabo por las peptidoglicán desacetilasas que N-desacetilan los residuos NAM o NAG del peptidoglicano, impidiendo su reconocimiento por el sistema inmune.
El presente trabajo está dividido en tres partes. Primero se llevó a cabo un estudio bibliográfico de hidrolasas y autolisinas. En segundo lugar se expresaron y purificaron las quitín desacetilasas BgCDA y SpCDA. Para lo cual, previamente se observó que estas proteínas se expresaban de forma insoluble, por lo que para llevar a cabo la purificación por cromatografía de afinidad StrepTrap, primero había que desnaturalizar la proteína con urea y después realizar refolding por diálisis para que estas proteínas se plegaran de forma soluble. Además, se llevó a cabo la cuantificación y medida de actividad usando como sustrato el acetato metilumbeliferona (AcMU). Por último, para poder caracterizar las peptidoglicán desacetilasas, es necesario usar fragmentos de peptidoglicano de diferente composición. Estos se pueden obtener digiriendo el peptidoglicano con diferentes autolisinas. En esta tercera parte del trabajo, se expresaron, purificaron y caracterizaron las autolisinas CwlE (DL-endopeptidasa) y CwlH (N-acetilmuramil-L-alanina amidasa) de Bacillus subtilis. La medida de la actividad enzimática se llevó a cabo por detección de grupos aminos libres usando DNFB como marcador y analizado por HPLC. Estas dos autolisinas purificadas se pueden usar para generar fragmentos de peptidoglicano específicos que pueden actuar como sustratos de las peptidoglicán desacetilasas para su caracterización.
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