|
Autor/a
González Camarero, Rebeca
|
Abstract
La quitina és un polisacàrid lineal compost per monòmers de NAG (N-acetilglucosamina) units per enllaços β-1,4. És el amino sacàrid natural més abundant i el segon biopolímer natural més abundant en el món després de la celulasa. Les quitín desacetilases (CDAs) N-desacetilan els residus de NAG dels polímers i oligòmers de quitina generant quitosanos i quitooligosacáridos parcialment acetilats (pacos). La quitina i els seus derivats són molècules molt interessants ja que presenten una àmplia varietat d'aplicacions en la medicina i en la indústria alimentària, farmacèutica i cosmètica entre d'altres. El quitosan és l'únic polisacàrid policatiónico natural, el que li permet interactuar amb biomolècules polianiónicas (membrana, àcids nucleics, proteïnes ...). L'activitat biològica de l'quitosan depèn fortament del grau d'acetilació (DA), el seu grau de polimerització (DP) i el seu patró de acetilació (PA). A causa d'això ja que les diferents CDAs generen diferents PA i DA, és de gran interès caracteritzar diferents CDAs perquè es puguin fer servir com a catalitzadors en la producció de quitooligosacárido i PaCOS amb un PA i DA específic, de manera que puguin estudiar les seves activitats biològiques i usar-se en diferents camps.
El component principal de la paret cel·lular bacteriana és el peptidoglicà, que protegeix la cèl·lula davant de diverses condicions ambientals i consisteix en una cadena de glicà NAG-NAM covalentment unida a una tija peptídic (stem peptide). Les autolisines intervenen en la contínua síntesi, hidròlisi i modificació del peptidoglicà, permetent el creixement i divisió bacteriana, així com la realització d'altres funcions biològiques (com patogenicitat, canibalisme, esporulació, germinació d'espores ...). A més, els fragments de peptidoglucano alliberats per aquestes autolisinas poden ser detectats pel sistema immune del hoste durant una infecció, el que produeix una resposta immune. Per evitar això, alguns bacteris patògens modifiquen la seva peptidoglicà mitjançant diferents mecanismes. Un d'aquests mecanismes és dut a terme per les peptidoglicans desacetilases que N-desacetilan els residus NAM o NAG del peptidoglicà, impedint el seu reconeixement pel sistema immune. El present treball està dividit en tres parts. Primer es va dur a terme un estudi bibliogràfic de hidrolases i autolisines. En segon lloc es van expressar i purificar les quitines desacetilases BgCDA i SpCDA. Per la qual cosa, prèviament es va observar que aquestes proteïnes s'expressaven de forma insoluble, de manera que per dur a terme la purificació per cromatografia d'afinitat StrepTrap, primer calia desnaturalitzar la proteïna amb urea i després realitzar refolding per diàlisi. A més, es va dur a terme la quantificació i mesura d'activitat usant com a substrat l'acetat metilumbeliferona (AcMU). Finalment, per poder caracteritzar les peptidoglicán desacetilases, cal fer servir fragments de peptidoglicà de diferent composició. Aquests es poden obtenir digerint el peptidoglicà amb diferents autolisines. En aquesta tercera part de la feina, es van expressar, van purificar i caracteritzar les autolisines CwlE (DL-endopeptidasa) i CwlH (N-acetilmuramil-L-alanina amidasa) de Bacillus subtilis. La mesura de l'activitat enzimàtica es va dur a terme per detecció de grups aminos lliures usant DNFB com a marcador i analitzat per HPLC. Aquestes dues autolisines purificades es poden utilitzar per generar fragments de peptidoglicà específics que poden actuar com a substrats de les peptidoglicans desacetilases per a la seva caracterització.
|
|
