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Autor/a
Soler Palazón, Adrià
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Abstract
La ruta Hedgehog (Hh) es una cascada de señalización crucial en el proceso de embriogénesis. En multitud de vertebrados se ha identificado el gen Sonic Hedgehog (SHH), gen que codifica la proteína Sonic Hedgehog (Shh) y que es capaz de actuar como ligando en la ruta de señalización Hh. Esta proteína es esencial para su activación porque provoca la transcripción de diversos genes, hecho que no ocurre en ausencia de la proteína mencionada. La afinidad del ligando con el receptor depende del ácido graso presente en el dominio N-terminal de la proteína Shh (ShhN), pero no del componente presente en la parte C-terminal, ya que la ausencia de su fragmento habitualmente presente, el colesterol, no provoca el mismo efecto en la afinidad.
En los últimos años, se ha podido establecer que la ruta de señalización Hh puede ser modulada a través de la intervención de algunos agentes, como la Robotnikinina y el anticuerpo 5E1, que actúan como inhibidores. Estos estudios se llevaron a cabo porque se encontró que algunos cánceres presentaban una activación inapropiada de la ruta de señalización Hh. Estos dos agentes mencionados son de las pocas moléculas que se han publicado capaces de unirse a la proteína ShhN. Así, reviste especial interés el identificar agentes moduladores alternativos por los que este trabajo está enfocado a la síntesis de nuevos inhibidores de naturaleza peptídica de la proteína ShhN. A lo largo de la tesis anterior llevada a cabo en el equipo, se identificaron secuencias peptídicas capaces de reconocer a la proteína estudiada, utilizando para ello la técnica Phage display, en concreto frente a la versión de la proteína Palm-ShhN-Biotin.
Los únicos clones obtenidos de la biblioteca correspondiente fueron preparados mediante tecnología de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) y, además, se han llevado a cabo algunas modificaciones en su secuencia peptídica. Así mismo, se ha ligado un péptido de 25 aminoácidos que tiene un grupo tioéster en su dominio C-terminal, con la cisteína del extremo N- terminal de los distintos fragmentos peptídicos de 37 aminoácidos, mediante la técnica conocida como ligación química nativa (NCL). Los péptidos resultantes de 62 aminoácidos son obtenidos con rendimientos entre el 37 % y el 70 %. Seguidamente, se procede a la desulfuración de los mismos que son posteriormente purificados con rendimientos entre el 59 % y el 75 %.
Todas estas transformaciones se han ido monitorizando mediante diferentes técnicas como la cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) y espectrometría de masas MALDI-TOF. Los péptidos purificados se han caracterizado a su vez mediante espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI). Finalmente, el plegamiento de los mismos se ha estudiado por dicroísmo circular (CD) y se ha calculado su porcentaje de hélice alfa. La unión péptido - proteína se han estudiado mediante el gel de electroforesis nativo (PAGE) y la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) combinado con SDS-PAGE como método de detección, y así ver la afinidad que tienen estes posibles inhibidores con la proteína. Los resultados no han sido concluyentes para la proteína His6-SUMO-ShhN. El trabajo futuro se centra en el análisis de dicha unión utilizando la técnica denominada superficie de plasmón superficial (SPR).
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