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Autor/a
Grau García, Paula
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Abstract
Las células de insecto se utilizan extensamente como plataforma de producción de proteínas recombinantes que requieren ciertas modificaciones posttraduccionales básicamente a partir del sistema BEVS (Sistema de Vector de Expresión de Baculovirus), que presenta alta productividad. Otras ventajas de esta plataforma son la capacidad de lograr altas concentraciones celulares, los rendimientos de producción y el bajo coste de los medios de cultivo en comparación a otros sistemas como las células de mamífero. Aun así, la preparación del stock vírico y la carga adicional de purificación asociada a la necesidad de separar los baculovirus de la proteína producida son los principales inconvenientes de esta plataforma. La motivación de este trabajo es la de explorar el desarrollo de un sistema de producción utilizando células de insecto sin la necesidad de usar baculovirus.
La expresión génica estable (SGE) permite obtener una población celular estable para la producción de proteínas recombinantes. Con esto, se consigue una expresión génica constitutiva mediante la integración del gen de interés en el genoma celular a través de una integración aleatoria. Después, se puede mejorar la expresión de proteínas enriqueciendo la población con una proporción más grande de células productoras mediante citometria de flujo.
En este trabajo, se ha estudiado la producción estable en dos líneas celulares estables, Spodoptera frugiperda (Sf9) y Trichoplusia ni (Hi5), en cultivos en suspensión produciendo dos proteínas modelo distintas, mCherry y Gag::eGFP. Las líneas celulares probadas son las células de insecto mas ampliamente utilizadas para la expresión de proteínas y las dos proteínas se seleccionaron porque tienen una estructura muy diferente, siendo mCherry una proteína simple mientras que Gag :: eGFP está formando una estructura de poliproteina, llamada virus-like particles (VLP) procesada internamente por la célula y exportada a través de la membrana celular mediante un proceso de excreción. Además, ambas proteínas son fluorescentes, lo cual facilita la trazabilidad de su producción y selección de células mediante citometría de flujo.
Las diferentes poblaciones de células desarrolladas en este trabajo se comparan en términos de fluorescencia para analizar la concentración de proteína producida. El porcentaje de células recombinantes y la intensidad de fluorescencia mediana también se analiza mediante citometría de flujo. Como la proteína Gag::eGFP es una poliproteïna autoensamblable y secretable, permite estudiar la capacidad de excreción de las dos líneas celulares por fluorescencia en el sobrenadante y se realiza una observación cualitativa mediante microscopia de crío-transmisión electrónica (crío-TEM).
Los resultados obtenidos indican que los clones celulares desarrollados con este enfoque son buenos candidatos para la producción estable de proteínas recombinantes sencillas y complejos proteicos, obteniendo una concentración total de proteína de 2,68·103 ± 0,45 μg/ml en las células Sf9 y de 1,63·103 ± 0,29 μg/ml en las Hi5 en el caso de mCherry. Las concentraciones obtenidas de Gag::eGFP fueron de 7,48 ± 0,27 μg/ml en Sf9 y de 14,77 ± 0,34 μg/ml en las Hi5. En referencia a la excreción de la proteína Gag::eGFP, esta no fue detectable en la línea celular de Hi5 y fue detectable a bajos niveles para el caso de Sf9,siendo 7,48 ± 0,27 μg/ml y representado una producción de 1,04·103 ± 0,56 *ng/ml de VLPs. Este hecho parece indicar que estas células presentan algún cuello e botella en el procesado de células complejas en la membrana.
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