|
Autor/a
Grau García, Paula
|
Abstract
Les cèl·lules d’insecte s’utilitzen extensament com a plataforma de producció de proteïnes recombinats que requereixen certes modificacions post-traduccionals bàsicament a partir del sistema BEVS (Sistema de Vector d’Expressió de Baculovirus), que té una alta productivitat. Altres avantatges d’aquesta plataforma són la capacitat d’assolir altes concentracions cel·lulars, els rendiments de producció i el baix cost dels medis de cultiu en comparació a altres sistemes com les cèl·lules de mamífer. Tot i això, la preparació de l’estoc víric i la càrrega addicional de purificació associada a la necessitat de separar els baculovirus de la proteïna produïda són els principals inconvenients d’aquesta plataforma. La motivació d’aquest treball es la d’explorar el desenvolupament d’un sistema de producció utilitzant cèl·lules d’insectes sense la necessitat d’emprar baculovirus.
L’expressió gènica estable (SGE) permet obtenir una població cel·lular estable per la producció de proteïnes recombinats. Amb això, s'aconsegueix una expressió genètica constitutiva mitjançant la integració del gen d'interès en el genoma cel·lular a través d’una integració aleatòria. Després, es pot millorar l'expressió de proteïnes enriquint la població amb una proporció més gran de cèl·lules productores mitjançant citometria de flux.
En aquest treball, s’ha estudiat la producció estable en dues línies cel·lulars, Spodoptera frugiperda (Sf9) i Trichoplusia ni (Hi5), en cultius en suspensió produint dues proteïnes model, mCherry i Gag::eGFP. Les línies cel·lulars provades són les cèl·lules d’insecte més àmpliament utilitzades per a l’expressió de proteïnes, i les dues proteïnes es van seleccionar perquè tenen una estructura molt diferent, essent mCherry una proteïna simple mentre que Gag :: eGFP està formant una estructura de poliproteïna, anomenada virus-like particles (VLP) processada internament per la cèl·lula i exportada a través de la membrana cel·lular mitjançant un procés d’excreció. A més, ambdues proteïnes són fluorescents, la qual cosa facilita la traçabilitat de la seva producció i la selecció de cèl·lules mitjançant citometria de flux.
Les diferents poblacions de cèl·lules desenvolupades en aquest treball es comparen en termes de fluorescència per analitzar la concentració de proteïna produïda. El percentatge de cèl·lules recombinants i la intensitat de fluorescència mitjana també s’analitzen mitjançant citometria de flux. Com que la proteïna Gag::eGFP és una poliproteïna autoenssemblable i secretable, permet estudiar la capacitat d’excreció de les dues línies cel·lulars (fluorescència en el sobrenedant) i es realitza una observació qualitativa mitjançant microscòpia de crio-transmissió electrònica (crio-TEM).
Els resultats obtinguts indiquen que els clons cel·lulars desenvolupats amb aquest enfocament són bons candidats per la producció estable de proteïnes recombinants senzilles i complexes proteics, obtenint-se una concentració total de proteïna de 2,68·103 ± 0,45 μg/mL en les cèl·lules Sf9 i de 1,63·103 ± 0,29 μg/mL en les Hi5 en el cas de mCherry. Les concentracions obtingudes de Gag::eGFP van ser de 7,48 ± 0,27 μg/mL en Sf9 i de 14,77 ± 0,34 μg/mL en les Hi5. En referència a la capacitat d’excreció de la proteína Gag::eGFP, aquesta no va ser detectable en la linia cèl·lular de Hi5 i van ser detectables a baix nivell en Sf9 ( 7,48 ± 0,27 μg/mL), representat una producció de 1,04·103 ± 0,56 ng/mL de VLPs. Aquest fet sembla indicar que aquestes cèl·lules presenten algun coll d’ampolla en el processament de partícules complexes a la membrana.
|
|
