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Autor/a
Garcia Torrado, Alejandro
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Abstract
El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más agresivo, y la esperanza de vida es de 15 a 20 meses después del diagnóstico. El estrecho índice terapéutico de las quimioterapias, la dificultad para atravesar la barrera hematoencefálica en los márgenes del tumor y la heterogeneidad de las células en la masa tumoral, disminuyen la eficacia de los tratamientos actuales. Este trabajo de investigación de máster forma parte de un proyecto europeo que tiene como objetivo desarrollar un sistema de entrega de genes dirigido como un tratamiento novedoso para la GBM.
Aquí generamos ligandos de selectividad para dirigir el sistema de entrega de genes a las células tumorales que sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) con la máxima eficiencia. Para ello, seleccionamos dos análogos de anticuerpos, un nanobody y una Proteína de Repetición de Ankirina Diseñada (DARPin), e ideamos una estrategia para conjugarlos a la nanopartícula de forma orientada. Esta estrategia consiste en incorporar aminoácidos reactivos no canónicos (ncAAs) o residuos de cisteína en sitios seleccionados que deberían permitir la conjugación sin afectar la unión al antígeno.
Aunque logramos clonar los amber stop codons necesarios para codificar los ncAA en el nanobody, esta proteína no se expresó en ninguna de las numerosas condiciones que se intentaron. Por el contrario, logramos expresar y purificar la DARPin anti-EGFR. Luego evaluamos la capacidad de unión de la DARPin en las células que expresan diferentes niveles de EGFR. Encontramos que la Kd aparente de los anticuerpos variaba entre 0,9 nM y 35 nM en buena concordancia con la expresión esperada del EGFR. Los ensayos de competencia mostraron una disminución del 75% en la unión de la DARPin marcada cuando se preincubaban las células con la proteína no marcada. Estos resultados confirmaron que la proteína estaba correctamente plegada y que la interacción dependía del EGFR. Además, para estos experimentos de unión se utilizó la DARPin se fusionó con glutatión S-trasnferasa (GST), lo que indicó que la DARPin tiene la capacidad de dirigir grandes cargas a las células EGFR+.
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