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Autor/a
Gómez del Campo Tirado, Fernando
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Abstract
La leche materna humana es una mezcla compuesta de proteínas complejas, lípidos, carbohidratos y otros componentes biológicamente activos. Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) son complejos moléculas de azúcar que se encuentran exclusivamente en altas concentraciones en la leche materna humana. Ellos se sintetizan exclusivamente en las glándulas mamarias durante la lactancia y ejercen un prebiótico efecto para el lactante una vez ingerido, siendo procesado principalmente por bacterias de la Bifidobacterium género. Los HMO participan en la maduración, el desarrollo y el bloqueo del patógeno del intestino del bebé. adhesión en el tracto gastrointestinal y ayuda en la modulación del sistema inmunológico, entre otros funciones. Esto hace que las HMO sean un activo muy valioso para agregar a la fórmula infantil, y no Hay un interés considerable en desarrollar formas rentables de producirlos.
Se han caracterizado más de 200 HMO, y las dos estructuras centrales centrales son las tetrasacáridos: lacto-N-tetraosa (LNT), caracterizada por lacto-N-biosa (LNB; Galβ1,3Glc- NAc) y una unidad de lactosa, y lacto-N-neo-tetraosa (LNnT), formada por N-acetillactosamina (Galβ1,4GlcNAc) y lactosa. En los seres humanos, LNT predomina sobre LNnT como estructura central para las HMO presentes, lo que hace que LNT sea interesante para aplicaciones en la industria alimentaria.
Sin embargo, la producción de LNT mediante síntesis química plantea un problema, ya que se requieren numerosos pasos. necesarios y se obtienen bajos rendimientos. Sin embargo, la síntesis enzimática de LNT es un interesante alternativa, ya que las enzimas glucohidrolíticas naturales pueden modificarse mediante ingeniería producen actividad de transglicosilación. Lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum (LnbB) es una Enzima exo-retenedora de la familia GH20, presente de forma natural en el microbioma intestinal humano, que hidroliza LNT en LNB y lactosa. Posee actividad de transglicosilación, aunque en eficiencia catalítica muy baja, y la relación de actividad de transglicosilación / hidrólisis (T / H) puede modificarse utilizando técnicas de ingeniería de proteínas para un diseño racional, mediante la mutación de aminoácidos clave ácidos en el sitio activo de la enzima.
Con este propósito en mente, el Laboratorio de Bioquímica del IQS está trabajando en ingeniería enzimática. de LnbB con el objetivo de desarrollar un biocatalizador para la síntesis de LNT. Basado en una herramienta in-silico desarrollado en el grupo (BINDSCAN) que predice posiciones dentro de una enzima que son sensibles a la unión de un sustrato elegido, se identificaron varios residuos diana cuya mutación puede aumentar la afinidad de unión por la lactosa como sustrato aceptor, lo que teóricamente aumentar la relación T / H haciendo que el sustrato esté más disponible en el sitio catalítico para transglicosilación.
Se propusieron dos mutantes (I324W, V426W) que pueden aumentar la afinidad de unión de la lactosa en los subsitios positivos de LnbB (y potencialmente aumentar la relación T / H de LNT). Aquí, el mutante proteínas fueron producidas y probadas para la actividad de transglicosilación in vitro y combinadas con un mutante activo de transglicosilación previamente identificado (W394F) y el WT en todos los combinaciones. Se encontraron dos mutantes (W394F / V426W y W394F / I324W / V426W) tienen actividad de transglicosilación. El primero produce LNT casi de inmediato, y ambos mutantes se muestran prometedores en términos de rendimiento de LNT y son candidatos para una mayor ingeniería enzimática programas.
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