|
Autor/a
Gómez del Campo Tirado, Fernando
|
Abstract
La llet materna humana és una barreja composta per proteïnes complexes, lípids, hidrats de carboni i altres components biològicament actius. Els oligosacàrids de la llet humana (HMO) són complexos de molècules de sucre que es troben exclusivament en concentracions elevades a la llet materna humana. Es sintetitzen exclusivament a les glàndules mamàries durant la lactància i exerceixen un prebiòtic efecte per al lactant un cop ingerit, essent processat principalment per bacteris del Bifidobacterium gènere. Els HMO intervenen en la maduració, desenvolupament i bloqueig de l’intestí del patogen del lactant adhesió al tracte gastrointestinal i ajuda a la modulació del sistema immunitari, entre d’altres funcions. Això fa que els HMO siguin un valor molt valuós que s’afegeixi a la fórmula infantil i té un interès considerable en desenvolupar formes rendibles de produir-les.
S’han caracteritzat més de 200 HMO, i les dues estructures centrals centrals són tetrasacàrids: lacto-N-tetraosa (LNT), caracteritzat per lacto-N-biosa (LNB; Galβ1,3Glc-NAc) i una unitat de lactosa, i lacto-N-neo-tetraosa (LNnT), formada per N-acetilactosamina (Galβ1,4GlcNAc) i lactosa. En humans, LNT predomina sobre LNnT com a estructura bàsica per als HMO presents, cosa que fa que LNT sigui interessant per a aplicacions en la indústria alimentària. No obstant això, produir LNT mitjançant síntesi química planteja un problema, ja que hi ha nombrosos passos requerits i s’aconsegueixen baixos rendiments. No obstant això, la síntesi enzimàtica de LNT és interessant alternativa, ja que els enzims glicohidrolítics que es produeixen de forma natural poden transformar-se en produeixen activitat de transglicosilació. La lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum (LnbB) és un enzim retentor exo de la família GH20, present naturalment al microbioma intestinal humà, que hidrolitza LNT en LNB i lactosa. Posseeix activitat de transglicosilació, encara que a una eficiència catalítica molt baixa i la proporció d'activitat de transglicosilació / hidròlisi (T / H) pot ser modificat mitjançant tècniques d'enginyeria de proteïnes per al disseny racional, mitjançant la mutació d'amino clau àcids al lloc actiu de l’enzim. Amb aquest propòsit en ment, el Laboratori de Bioquímica d’IQS treballa en enginyeria enzimàtica de LnbB dirigit a desenvolupar un biocatalitzador per a la síntesi de LNT. Basat en una eina in-silico desenvolupat al grup (BINDSCAN) que prediu posicions sensibles dins d’un enzim a la unió d'un substrat escollit, es van identificar diversos residus diana la mutació dels quals pot augmentar l’afinitat d’unió per la lactosa com a substrat acceptor, cosa que teòricament seria augmentar la relació T / H fent que el substrat estigui més disponible al lloc catalític per a transglicosilació.
Es van proposar dos mutants (I324W, V426W) que poden augmentar l’afinitat d’unió de la lactosa en els subsites positius de LnbB (i potencialment augmentar la relació T / H de LNT). Aquí, el mutant es van produir proteïnes i es van provar l'activitat de transglicosilació in vitro i combinades amb un mutant actiu de transglicosilació identificat prèviament (W394F) i el WT en tot el possible combinacions. Es van trobar dos mutants (W394F / V426W i W394F / I324W / V426W) tenen activitat de transglicosilació. El primer produeix LNT gairebé immediatament, i tots dos mutants són prometedors en termes de rendiment de LNT i són candidats a una nova enginyeria enzimàtica programes.
|
|
