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Autor/a
Sánchez Gómez, Maria José
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Abstract
El desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico y tratamiento de múltiples patologías ha sido un desafío durante los últimos años. Los exosomas han surgido recientemente como nuevos sistemas de administración debido a su atractivo origen natural, su tamaño a nano escala y su función intrínseca de la comunicación intercelular. Sin embargo, existen varios desafíos que impiden su uso como sistemas terapéuticos. Entre ellos, la distinción de los exosomas del resto de componentes (otras vesículas, proteínas y partículas extracelulares), con una alteración mínima de sus propiedades físico-químicas y biológicas, sigue siendo un tema clave. Otros inconvenientes que aún deben superarse son las dificultades asociadas con la purificación de exosomas, el estudio de absorción y la biodistribución.
En este trabajo, se realizó el marcado selectivo de exosomas con marcadores específicos en líneas celulares A549 y HEK293, lo que permitió su monitorización específica además de otras vesículas y partículas extracelulares. Para ello, se construyeron varios plásmidos para expresar CD63 y CD69, dos proteínas de la familia de la tetraspaninas ubicadas específicamente en las membranas de los exosomas, fusionadas con etiquetas fluorescentes EGFP o mCherry. Además, se construyeron plásmidos bicistrónicos y tricistrónicos para permitir la expresión simultánea de uno o dos genes junto con un marcador de selección resistente a antibióticos, lo que permite la generación y selección eficiente de líneas celulares estables. La expresión de todas las proteínas de fusión diseñadas en este trabajo se analizó mediante citometría de flujo junto con visualización de microscopía fluorescente y confocal. Además, se logró un cultivo estable de células HEK293 que expresan fluorescencia mediante la resistencia a los antibióticos de mamíferos combinada con la tecnología de clasificación.
En conclusión, se logró la clonación de plásmidos deseada y se demostró que eran totalmente funcionales. La expresión de los plásmidos estudiados en este proyecto hace posible el marcaje fluorescente de vesículas. Siendo este etiquetado una ventaja para la investigación futura relacionada con el aislamiento de exosomas, la biodistribución y sus funciones potenciales como un vehículo terapéutico prometedor.
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