|
Autor/a
Sánchez Gómez, Maria José
|
Abstract
El desenvolupament de noves tècniques de diagnòstic i tractament de múltiples patologies ha estat un desafiament durant els últims anys. Els exosomes han sorgit recentment com a nous sistemes d'administració a causa del seu atractiu origen natural, la seva grandària a nano escala i la seva funció intrínseca de la comunicació intercel·lular. No obstant això, hi ha diversos desafiaments que impedeixen el seu ús com a sistemes terapèutics. Entre ells, la distinció dels exosomes de la resta de components (altres vesícules, proteïnes i partícules extracel·lulars), amb una alteració mínima de les seves propietats fisicoquímiques i biològiques, segueix sent un tema clau. Altres inconvenients que encara s'han de superar són les dificultats associades amb la purificació d’exosomes, l'estudi d'absorció i la biodistribució.
En aquest treball, es va realitzar el marcatge selectiu d'exosomes amb marcadors específics en línies cel·lulars A549 i HEK293, el que va permetre la seva monitorització específica a més d'altres vesícules i partícules extracel·lulars. Per aconseguir això, es van construir diversos plasmidis per expressar CD63 i CD69, dues proteïnes de la família de la tetraspanines ubicades específicament en les membranes dels exosomes, fusionades amb etiquetes fluorescents EGFP o mCherry. A més, es van construir plasmidis bicistrónics i tricistrónics per permetre l'expressió simultània d'un o dos gens juntament amb un marcador de selecció resistent a antibiòtics, el que permet la generació i selecció eficient de línies cel·lulars estables. L'expressió de totes les proteïnes de fusió dissenyades en aquest treball es va analitzar mitjançant citometria de flux juntament amb visualització de microscòpia fluorescent i confocal. A més, es va aconseguir un cultiu estable de cèl·lules HEK293 que expressen fluorescència mitjançant la resistència als antibiòtics de mamífers combinada amb la tecnologia de classificació.
En conclusió, es va aconseguir la clonació de plasmidis desitjada i es va demostrar que eren totalment funcionals. L'expressió dels plasmidis estudiats en aquest projecte fa possible el marcatge fluorescent de vesícules. Sent aquest etiquetatge un avantatge per a la investigació futura relacionada amb l'aïllament de exosomes, la biodistribució i les seves funcions potencials com un vehicle terapèutic prometedor.
|
|
