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Autor/a
Moral Blázquez, Nuria
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Abstract
La microscopía óptica de súper-resolución nos permite visualizar el interior celular con una resolución que supera hasta 10 veces la que hasta entonces se había alcanzado con los microscopios convencionales. Inventada hace más de 25 años, la microscopía de reducción de emisión estimulada (STED) se ha convertido en un método estándar y ampliamente utilizado para la obtención de imágenes en las ciencias de la vida. Gracias al progreso tecnológico continuo, la microscopía STED ahora puede proporcionar una resolución efectiva, al tiempo que conserva la mayoría de los aspectos útiles de la microscopía de fluorescencia, como el seccionamiento óptico, la especificidad y sensibilidad molecular y la compatibilidad de estudiar células vivas.
Al principio del desarrollo de la microscopía STED, la cantidad de fluoróforos que se podían usar en el proceso era muy limitado. La rodamina B fue nombrada en la primera descripción teórica de STED. Como resultado, los primeros marcadores utilizados fueron emisores de láser en el espectro rojo. Para permitir el análisis STED de sistemas biológicos, los fluoróforos y las fuentes de láser deben adaptarse al sistema. Consecuentemente, no todos los fluoróforos son aptos para ser utilizados como marcadores para microscopía STED. Estos deben de presentar unas características muy concretas, alta fotoestabilidad, elevada intensidad de fluorescencia y coeficientes de extinción aproximadamente de 105 cm-1 M-1. Este deseo de un mejor análisis de estos sistemas ha llevado a realizar STED de células vivas y STED multicolor, pero también ha exigido marcadores y sistemas de excitación cada vez más avanzados para adaptarse con mayor funcionalidad. Uno de esos avances fue el uso de células inmunomarcadas. Estas células son marcadas mediante anticuerpos conjugados con fluoróforos aptos para la microscopía STED. Aunque estos pueden ser comprados, la conjugación también pude ser realizada por los investigadores, teniendo así la posibilidad de variar el número de fluoróforos conjugados por anticuerpo. En este proyecto se ha estudiado la optimización del marcaje fluorescente mediante inmunotinción de células fijadas químicamente para la microscopía STED. La primera aproximación para la optimización fue hacer una comparativa entre anticuerpos conjugados fluorescentes comerciales y anticuerpos conjugados fluorescentes desarrollados en el laboratorio (In-House). Se compararon parámetros como la fotoestabilidad y Signal-to-noise ratio. Por otro lado, también se ha estudiado el marcaje fluorescente en células vivas. Distintos marcadores comerciales específicos sugeridos para la técnica de STED, han sido evaluados con la finalidad de optimizar la concentración y los tiempos de incubación en distintas líneas celulares. Finalmente, también se estudió la posibilidad de usar otros marcadores existentes para célula viva no probados con anterioridad para la técnica de STED. Con los cuales se estudió la concentración, los tiempos de incubación y la fotoestabilidad. Además, se trató de optimizar los parámetros de análisis de imagen de cada fluoróforo para la microscopía STED y se han generado códigos para automatizar dichos análisis.
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