Optimización del marcaje fluorescente en muestra fijada y viva para microscopía STED

Autor/a

Moral Blázquez, Nuria

Abstract

La microscòpia òptica de súper-resolució ens permet visualitzar l'interior cel·lular amb una resolució que supera fins a 10 vegades la que fins llavors s'havia aconseguit amb els microscopis convencionals. Inventada fa més de 25 anys, la microscòpia per esgotament d’emissions estimulades (STED) s'ha convertit en un mètode estàndard i àmpliament utilitzat per a l'obtenció d'imatges en les ciències de la vida. Gràcies al progrés tecnològic continu, la microscòpia STED ara pot proporcionar una resolució efectiva, a el temps que conserva la majoria dels aspectes útils de la microscòpia de fluorescència, com el seccionament òptic, l'especificitat i sensibilitat molecular i la compatibilitat d'estudiar cèl·lules vives. Al principi del desenvolupament de la microscòpia STED, la quantitat de fluoròfors que es podien fer servir en el procés era molt limitat. La rodamina B va ser nomenada en la primera descripció teòrica de STED. Com a resultat, els primers marcadors utilitzats van ser emissors de làser en l'espectre vermell. Per permetre l'anàlisi STED de sistemes biològics, els fluoròfors i les fonts de làser s'han d'adaptar al sistema. Conseqüentment, no tots els fluoròfors són aptes per ser utilitzats com a marcadors per microscòpia STED. Aquests han de presentar unes característiques molt concretes, elevada fotoestabilitat i intensitat de fluorescència i coeficients d'extinció aproximadament de 105 cm-1 M-1. El desig d'un millor anàlisi d'aquests sistemes ha portat a realitzar STED de cèl·lules vives i STED multicolor, però també ha exigit marcadors i sistemes d'excitació cada vegada més avançats per adaptar-se amb major funcionalitat.
Un d'aquests avenços va ser la utilització de cèl·lules inmunomarcadas. Aquestes cèl·lules són marcades mitjançant anticossos conjugats amb fluoròfors aptes per a la microscòpia STED. Tot i que aquests poden ser comprats, la conjugació també pot ser realitzada pels investigadors, tenint així la possibilitat de variar el nombre de fluoròfors conjugats per anticòs. En aquest projecte s'ha estudiat l'optimització del marcatge fluorescent mitjançant immunotinció de cèl·lules fixades químicament per a la microscòpia STED. La primera aproximació per a l'optimització va ser fer una comparativa entre anticossos conjugats fluorescents comercials i anticossos conjugats fluorescents desenvolupats en el laboratori (In-House). Es van comparar paràmetres com la fotoestabilidad i Signal-to-noise ratio. D'altra banda, també s'ha estudiat el marcatge fluorescent en cèl·lules vives. Diferents marcadors comercials específics suggerits per la tècnica STED, han estat avaluats amb la finalitat d'optimitzar la concentració i els temps d'incubació en diferents línies cel·lulars. Finalment, també es va estudiar la possibilitat d'utilitzar altres marcadors existents per cèl·lules vives no provats amb anterioritat per la
tècnica STED. Amb els quals es va estudiar la concentració, els temps d'incubació i la fotoestabilitat. A més, es va tractar d'optimitzar els paràmetres d'anàlisi d'imatge de cada fluoròfor per a la microscòpia STED i es van generar codis per automatitzar aquest anàlisis.

Director/a

Fornaguera i Puigvert, Cristina
Marsal, Maria; Loza-Álvarez, Pablo

Estudis

IQS SE - Grau en Biotecnologia

Data

2021-06-17