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Autor/a
Martín Rosco, Raúl
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Abstract
A pesar de la enorme contribución de los sistemas de expresión génica clásicos, hay la necesidad de técnicas más precisas tanto temporal como espacialmente. La optogenética es una disciplina que controla circuitos genéticos en células vivas mediante la luz, la cual proporciona una gran resolución espaciotemporal. Combinando un fotorreceptor proveniente de plantas (phyB) fusionado a la Cas9 mutante sin actividad endonucleasa (dCas9) y un componente efector compuesto por el dominio de unión al phyB (APB) fusionado a un represor transcripcional, se puede construir un sistema de expresión génico ortogonal y modulable según la luz para controlar la expresión de genes tanto endógenos como exógenos dependiendo de la exposición a luz roja o luz roja lejana en la microalga C. reinhardtii.
El objetivo de este proyecto es diseñar y analizar la parte del sistema formada por el dominio APB fusionado al represor transcripcional. Se han seleccionado 4 dominios APB provenientes de A. thaliana (P3, P6A, P6 y P7) y se ha diseñado un gen sintético, el cual se ha nombrado OptoRepresor (OR). OR está compuesto por el mejor candidato APB (P6.100), por un epítopo para detección mediante western blot (MYC), por un represor transcripcional (KRAB) y por una señal de localización nuclear (SV40). Además, sus codones se han optimizado y se han introducido dos intrones a lo largo de la secuencia para mejorar su expresión. Los 4 dominios APB y el OR se han clonado en los vectores pOptimized, que permiten la fusión del gen de interés a una proteína fluorescente, en este caso, la mCerulean3. A continuación, se identificaron colonias transformantes de C. reinhardtii con una alta expresión de la proteína mCerulean3 sola mediante fluorimetría y westrern blot. Estas colonias se usaron como controles positivos. Finalmente, se analizó la expresión de los genes P3, P7 y OR en C. reinhardtii mediante fluorimetría y western blot. No se identificaron colonias transformantes con una expresión detectable de ninguno de estos genes. Para mejorar la expresión de genes recombinantes y su caracterización, se han propuesto otras estrategias de screening y nuevos vectores.
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