|
Autor/a
Martín Rosco, Raúl
|
Abstract
Tot i la gran contribució de sistemes d’expressió gènica clàssics, hi ha la necessitat de tècniques més precises tant temporal com espacialment. L’optogenètica és una disciplina que controla circuits genètics en cèl·lules vives mitjançant la llum, la qual dona una gran resolució espaitemporal. Combinant un fotoreceptor provinent de plantes (phyB) fusionat a la Cas9 mutant sense activitat endonucleasa (dCas9) i un component efector format per un domini d’unió al phyB (APB) fusionat a un repressor transcripcional, es pot construir un sistema d’expressió gènic ortogonal i modulable segons la llum per controlar l’expressió de gens tant endògens com exògens depenent de l’exposició a llum vermella o llum vermella llunyana en la microalga C. reinhardtii.
L’objectiu d’aquest projecte és dissenyar i analitzar la part del sistema format pel domini APB fusionat al repressor transcripcional. S’han seleccionat 4 dominis APB provinents d’A. thaliana (P3, P6A, P6 i P7) i s’ha dissenyat un gen sintètic, el qual s’ha nombrat OptoRepresor (OR). OR està format pel millor candidat APB (P6.100), per un epítop per detecció mitjançant western blot (MYC), per un repressor transcripcional (KRAB) i per una senyal de localització nuclear (SV40). A més, els seus codons s’han optimitzat i s’han introduït dos introns al llarg de la seqüència per millorar la seva expressió. Els 4 dominis APB i el OR s’han clonat en els vectors pOptimized, que permeten la fusió del gen d’interès a una proteïna fluorescent, en aquest cas, la mCerulean3. A continuació, es van identificar colònies transformants de C. reinhardtii amb una alta expressió de la proteïna mCerulean3 sola mitjançant fluorimetria i western blot. Aquestes colònies es van utilitzar com a controls positius. Finalment, es va analitzar l’expressió dels gens P3, P7 i OR en C. reinhardtii mitjançant fluorimetria i western blot. No es van identificar colònies transformants amb una expressió detectable de cap d’aquests gens. Per millorar l’expressió de gens recombinants i la seva caracterització, s’han proposat altres estratègies de screening i nous vectors.
|
|
