|
Autor/a
Vila Alarcón, Adrià
|
Abstract
Introducción: La alteración de la estructura y señalización mediada por el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1) está relacionada con la aparición de muchos tipos de patologías, destacando aquí las del cerebro, en particular los tumores neuroepiteliales de bajo grado (LGNET) los cuales son benignos. Con el objetivo de estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la formación y progresión de los LGNETs impulsados por FGFR1, se ha abordado el diseño de líneas celulares FGFR1-knockout (KO) mediante CRISPR/Cas9. Para ello, se requirió el ensamblaje de un ARN guía (gRNA) dirigido a los primeros exones del FGFR1 y la endonucleasa Cas9 que genera roturas de doble cadena (DSBs) para que se produzcan inserciones y deleciones (INDELs) debidas a la unión de extremos no homólogos (NHEJ).
Resultados: Tras un 65% y un 20% de eficiencia de lipofección de la maquinaria de edición génica para las líneas celulares de riñón embrionario humano (HEK293) y de oligodendroglioma humano (HOG), respectivamente; las células clasificadas a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se depositaron como células individuales en placas de 96 pocillos. Siendo cada pocillo una colonia de clones, un total de 196 y 111 clones de HEK293 y HOG, respectivamente, fueron cribados primero por técnicas de mayor rendimiento y menor selectividad y al final a la inversa (1ª: KO-PCR; 2ª: Western blot y 3ª: secuenciación Sanger). A pesar de no haber encontrado ningún tipo de clon FGFR1-KO, ni homocigoto ni heterocigoto, quedan candidatos que aún no han pasado por la secuenciación por falta de tiempo.
Conclusiones: Deberían haberse encontrado nuevos gRNAs con mayor eficiencia de edición durante los ensayos de validación in vivo con la endonucleasa I T7 (T7EI) antes del cribado. No obstante, los gRNAs utilizados actualmente fueron capaces de guiar a la Cas9 a los locus diana en los ensayos in vitro. No se ha identificado ningún clon FGFR1-KO homocigoto y se necesitan más análisis para evaluar la presencia de clones heterocigotos.
|
|
