|
Autor/a
Vila Alarcón, Adrià
|
Abstract
Introducció: L'alteració de l'estructura i senyalització del receptor del factor de creixement de fibroblasts 1 (FGFR1) està relacionada amb l'aparició de molts tipus de patologies, destacant aquí les de el cervell, en particular els tumors neuroepitelials de baix grau (LGNET) els quals són benignes. Amb l'objectiu d'estudiar els mecanismes moleculars subjacents a la formació i progressió dels LGNETs impulsats per l’FGFR1, s'ha abordat el disseny de línies cel·lulars FGFR1-knockout (KO) mitjançant CRISPR/Cas9. Per a això, es va requerir l'acoblament d'un ARN guia (gRNA) dirigit als primers exons de l'FGFR1 i l'endonucleasa Cas9 que genera trencaments de doble cadena (DSBs) perquè es produeixin insercions i delecions (INDELs) degudes a la unió d'extrems no homòlegs (NHEJ).
Resultats: Després d'un 65% i un 20% d'eficiència de lipofecció de la maquinària d'edició gènica per a les línies cel·lulars de ronyó embrionari humà (HEK293) i d’ oligodendroglioma humà (HOG), respectivament; les cèl·lules classificades a través de la classificació cel·lular activada per fluorescència (FACS) es van dipositar com a cèl·lules individuals en plaques de 96 pous. Sent cada pouet una colònia de clons, un total de 196 i 111 clons de HEK293 i HOG, respectivament, van ser cribrats primer per tècniques de major rendiment i menor selectivitat i a al final a l’inrevés (1a: KO-PCR; 2ª: Western blot i 3ª: seqüenciació Sanger). Tot i no haver trobat cap tipus de clon FGFR1-KO, ni homozigot ni heterozigot, queden candidats que encara no han passat per la seqüenciació per falta de temps.
Conclusions: S'haurien d'haver trobat nous gRNAs amb major eficiència d'edició durant els assajos de validació in vivo amb la endonucleasa I T7 (T7EI) abans del cribratge. No obstant això, els gRNAs utilitzats actualment van ser capaços de guiar la Cas9 als locus diana en els assajos in vitro. No s'ha identificat cap clon FGFR1-KO homozigot i es necessiten més anàlisis per avaluar la presència de clons heterozigots.
|
|
