|
Autor/a
Garcia Torrado, Alejandro
|
Abstract
El glioblastoma (GBM) és el tumor cerebral primari més agressiu, i l'esperança de vida és de 15 a 20 mesos després del diagnòstic. L'estret índex terapèutic de les quimioteràpies, la dificultat per a travessar la barrera hematoencefàlica en els marges del tumor i l'heterogeneïtat de les cèl·lules en la massa tumoral, disminueixen l'eficàcia dels tractaments actuals. Aquest treball de recerca de màster forma part d'un projecte europeu que té com a objectiu desenvolupar un sistema de lliurament de gens dirigit com un tractament nou per a la GBM.
Aquí generem lligands de selectivitat per a dirigir el sistema de lliurament de gens a les cèl·lules tumorals que sobreexpressen el receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) amb la màxima eficiència. Per a això, seleccionem dos anàlegs d'anticossos, un nanobody i una Proteïna de Repetició de Anquirina Dissenyada (DARPin), i ideem una estratègia per a conjugar-los a la nanopartícula de forma orientada. Aquesta estratègia consisteix a incorporar aminoàcids reactius no canònics (ncAAs) o residus de cisteïna en llocs seleccionats que haurien de permetre la conjugació sense afectar la unió a l'antigen.
Encara que aconseguim clonar els amber stop codons necessaris per a codificar els ncAA en el nanobody, aquesta proteïna no es va expressar en cap de les nombroses condicions que es van intentar. Per contra, aconseguim expressar i purificar la DARPin anti-EGFR. Després avaluem la capacitat d'unió de la DARPin en les cèl·lules que expressen diferents nivells de EGFR. Trobem que la Kd aparent dels anticossos variava entre 0,9 nM i 35 nM en bona concordança amb l'expressió esperada del EGFR. Els assajos de competència van mostrar una disminució del 75% en la unió de la DARPin marcada quan es preincubaven les cèl·lules amb la proteïna no marcada. Aquests resultats van confirmar que la proteïna estava correctament plegada i que la interacció depenia del EGFR. A més, per a aquests experiments d'unió es va utilitzar la DARPin es va fusionar amb glutatió S-transferasa (GST), la qual cosa va indicar que la DARPin té la capacitat de dirigir grans càrregues a les cèl·lules EGFR+.
|
|
