|
Autor/a
Soler Palazón, Adrià
|
Abstract
La ruta Hedgehog (Hh) és una cascada de senyalització decisiva en el procés de la embriogènesi. El gen Sonic Hedgehog (SHH) s’ha identificat en molts vertebrats, i la seva funció és codificar la proteïna Sonic Hedgehog (Shh), capaç d’actuar com a lligand en la ruta de senyalització Hh. Aquesta proteïna és essencial per la seva activació perquè provoca la transcripció de diversos gens, fet que no succeeix en absència de Shh. L’afinitat amb el receptor depèn molt de l’àcid gras present al domini N-terminal de la proteïna Shh (ShhN), i no tant del component present al domini C-terminal, ja que l’absència d’aquest segon fragment, habitualment colesterol, no provoca el mateix efecte en l’afinitat.
Durant els últims anys s’ha pogut establir que la ruta de senyalització Hh pot ser modulada a través de la intervenció d’alguns agents, com son la Robotnikinina i l’anticòs 5E1, que actuen com inhibidors del lligand ShhN. Aquests estudis es van realitzar des de que es va veure que alguns càncers presentaven una activació inapropiada de la ruta de senyalització Hh. Els dos agents mencionats son de les poques molècules publicades capaces d’unir-se a la proteïna ShhN. D’aquesta manera, interessa molt la identificació d’agents moduladors alternatius, motiu pel qual aquest treball està enfocat en la síntesi de nous inhibidors de naturalesa peptídica de la proteïna ShhN. Durant la tesi anterior realitzada a l’equip d’investigació, es van identificar seqüències peptídiques capaces de reconèixer la proteïna estudiada, gràcies a la tècnica Phage display, concretament contra la versió de la proteïna Palm-ShhN-Biotin.
Els únics clons obtinguts de la llibreria corresponent es van preparar a través de la tècnica síntesi de pèptids en fase sòlida (SPPS), i se’ls hi ha realitzat algunes modificacions en la seva seqüència peptídica. Seguidament, s’ha lligat un pèptid de 25 aminoàcids que conté un grup tioèster al seu extrem C-terminal, amb la cisteïna de l’extrem N-terminal dels diferents fragments peptídics de 37 aminoàcids, a través de la tècnica coneguda com unió química nativa (NCL). Els pèptids resultants de 62 aminoàcids s’han obtinguts amb rendiments d’entre el 37 % i el 70 %. Després, aquests s’han desulfuritzat obtenint rendiments d’entre el 59 % i el 75 %, i finalment s’han purificat.
Tots aquestes transformacions s’han anat monitoritzant a través de diferents tècniques com la cromatografia líquida d’alta resolució en fase reversa (RP-HPLC) i espectrometria de masses MALDI-TOF. Els pèptids purificats també s’han caracteritzat també mitjançant l’espectrometria de masses de ionització per electrospray (ESI-MS). Finalment, el plegament d’aquests pèptids s’ha estudiat fent dicroisme circular (CD) i calculant el seu percentatge d’hèlix alfa. La unió pèptid – proteïna s’ha estudiat mitjançant la electroforesis de gel natiu (PAGE) i la cromatografia d’afinitat de metalls immobilitzats (IMAC) combinada amb SDS-PAGE com a mètode de detecció, i així veure l’afinitat que tenen aquests possibles inhibidors amb la proteïna. Els resultats no han estat concloents per la proteïna His6-SUMO-ShhN. El treball futur se centra amb l’anàlisi de la unió esmentada utilitzant la tècnica anomenada superfície de plasmó superficial (SPR).
|
|
